scATAC-seq_v3用户手册
scATAC-seq_v3用户手册
1. 第一章 应用范围
scATAC-seq_v3可以处理以下试剂盒的高通量测序数据分析：
DNBelab C系列高通量单细胞ATAC文库制备试剂盒套装。
2. 第二章 产品介绍
2.1 分析流程图
scATAC-seq_v3分析流程是基于STOmics时空云平台系统开发的一款自动分析流程，其中包括参考基因组比对、反卷积（细胞鉴定与合并）、质控、检峰（peak calling）、下游分析，以及报告生成。
2.2 参考基因组比对
使用chromap (v0.2.3_r407) 将输入的FASTQ文件与参考基因组文件进行比对。
2.2.1 反卷积
使用d2c (v1.4.4) 捕获到完整细胞的beads，再根据beads中fragment中的相似性进行beads合并。
2.2.2 质控
进行片段分布统计和TSS区域富集，进行质控。
2.2.3 检峰
使用 macs2 (v2.2.7.1) 计算方法识别基因组中由测序得到的比对reads富集的区域，对ATAC而言，peak为开放染色质的区域，并生成peak-cell矩阵。
2.2.4 下游分析
基于生成的矩阵进行细胞质控，并进行降维、聚类、细胞类型注释等下游分析。
2.2.5 报告输出
综合分析结果，整理汇总成HTML报告。
3. 第三章 使用说明书
scATAC-seq_v3分析流程通过STOmics时空云平台系统进行样本输入及报告输出的全流程管理。下面具体介绍基于STOmics时空云平台系统使用scATAC-seq_v3分析流程的操作指南。
3.1 指南概述
本章介绍如何使用scATAC-seq_v3分析流程进行分析。在使用之前，请认真阅读并理解其中内容，保证能够正确使用scATAC-seq_v3分析流程。
3.2 使用场景一：手动投递
操作共包括四个步骤：上传数据、构建参考基因组（可选）、样本信息录入、启动分析。完成样本信息录入后，运行任务，当客户在看到任务状态为completed 时，代表任务已完成，即可查看报告部分（详见3.4部分）。
3.2.1 步骤一：上传数据
- 点击导航栏**【数据管理】，进入数据管理页面，进入目标文件夹，点击右上角【+添加文件】-【工具上传】**上传数据（图3-1）。
- 点击**【立即上传】浏览并选择所需文件（图3-2），上传完成后文件会在目标文件夹中显示（如首次上传，则需点击【安装并开启传输客户端】**安装所需工具）。
3.2.2 步骤二：构建参考基因组（可选）
- 点击导航栏**【流程分析】进入流程分析页面，在搜索框输入scATAC-seq-build-index**，点击**【运行】**（图3-3）。
- 选择运行界面输入，输入Entity ID，点击**【下一步】**（图3-4）。
- 录入参考基因组信息，完成后点击**【下一步】**（图3-5）。
注意
参考基因组信息录入参数说明：
- refName：参考基因组的物种名称；
- GTF：基因组注释GTF文件；
- chrM：线粒体名称；
- FASTA：基因组FASTA文件；
- blacklist：Blacklist文件，如没有则填None；
- Outdir：输出文件路径；
- Cpu：运行所需CPU；
- Mem：运行所需内存大小。
- 点击**【运行】**启动分析（图3-6）。
- 任务完成后，Status显示为completed，复制Task ID（图3-7），点击导航栏**【数据管理】，输入Task ID** 进行搜索（图3-8），其中 scATAC_ref 文件将作为参考基因组文件参与scATAC-seq_v3分析（图3-9）。
3.2.3 步骤三：样本信息录入
- 点击导航栏**【流程分析】**进入流程分析页面，在搜索框输入 scATAC-seq_v3，点击【运行】（图3-10）。
- 选择运行界面输入，输入Entity ID，点击**【下一步】**（图3-11）。
- 录入样本信息，完成后点击**【下一步】**（图3-12）。
注意
样本信息录入参数说明：
Data：FASTQ格式的R1、R2端序列，注意每对FASTQ要先选R1，再选R2；
Outdir：输出文件路径；
SampleID：样本名称，默认与Entity ID一致；
readStructure（选填）：测序方法，默认为newT1；
OutBam：是否需要输出bam文件，默认为false；
model：是否为模式生物（mouse/human），默认为false；
ForceFrag（选填）：用于合并重复数据的双重片段阈值的最小片段数；
refDir：参考基因组文件，如在步骤二（3.2.2 构建参考基因组）自主构建，选择Task ID文件夹内的scATAC_ref；
BlackList：Blacklist文件，默认为None；
chrMT：线粒体名称，默认为chrM；
genomeSize：基因组大小，与参考基因组构建的结果文件ref.json中genomesize的值一致；
cpp：运行所需CPU大小，默认值为4；
mem：运行所需内存大小，默认值为20；
Species：物种名称，如果model的值为true，则输入mm10或hg38。
3.2.4 步骤四：启动分析
点击**【运行】**启动分析（图3-13）。
3.3 使用场景二：表格投递
操作共包括五个步骤：上传数据、构建参考基因组（可选）、下载样本模板、填写并导入样本模板、启动分析。完成样本模板导入后，可批量运行任务，当客户在看到任务状态为completed 时，代表任务已完成，即可查看报告部分（详见3.4部分）。
3.3.1 步骤一：上传数据
与使用场景一（手动投递）步骤一一致（详见3.2.1步骤一：上传数据）。
3.3.2 步骤二：构建参考基因组（可选）
与使用场景一（手动投递）步骤二一致（详见3.2.2步骤二：构建参考基因组）。
3.3.3 步骤三：样本信息录入表格下载
- 点击导航栏**【数据管理】，选择【表格】-【下载模板】（如图3-14）, 点击【Data model template】**，选择 scATAC-seq_v3 模板下载。
- 打开后scATAC-seq_v3样本模板Excel如图3-15。
3.3.4 步骤四：样本信息导入
- 该使用场景条件下，样本导入表格需填写工作表（图3-15）。该场景表示对已测序完成的样本数据在导入表格后，直接进入分析。
注意
注意事项：
[1] 导入文件路径必须在云平台已存在。
[2] 模板中，除readStructure、ForceFrag外的输入栏为必填项。导入数据中，必填项字段不得为空。
[3] Excel中的SampleID需唯一。
[4] Excel中不能合并单元格，单元格内容前后不能有空格或特殊字符。
[5] 分析样本录入（图3-16）：
- Data：FASTQ格式的R1、R2端序列，注意每对FASTQ要先填写R1的绝对路径（Data1处），再填写R2的绝对路径（Data2处）；
- Outdir：输出文件路径；
- SampleID：样本名称，默认与Entity ID一致；
- readStructure（选填）：测序方法，默认为newT1；
- OutBam：是否需要输出bam文件，默认为false；
- model：是否为模式生物（mouse/human），默认为false；
- ForceFrag（选填）：用于合并重复数据的双重片段阈值的最小片段数；
- refDir：参考基因组文件，如在步骤二（3.3.2 构建参考基因组）自主构建，选择Task ID文件夹内的scATAC_ref文件；
- BlackList：Blacklist文件，默认为None；
- chrMT：线粒体名称，默认为chrM；
- genomeSize：基因组大小，与参考基因组构建的结果文件ref.json中的genomesize值一致；
- cpp：运行所需CPU大小，默认值为4；
- mem：运行所需内存大小，默认值为20；
- Species：物种名称，如果model的值为true，则输入mm10或hg38。
- 配置好样本模板的分析样本录入工作表后，回到**【数据管理】界面，点击【表格】-【+新增表格】**（图3-17）。
- 点击**【点击上传/拖拽到此区域】浏览并选择已填好样本信息的表格，点击【确定】**（图3-18），上传完成后文件会在目标文件夹中显示。
- 点击导航栏**【流程分析】进入流程分析页面，在搜索框输入scATAC-seq_v3****，点击【运行】**（图3-19）。
- 选择表格数据输入，点击 Please select table处，选择在本小节3）中导入的表格，选中所需的行，点击**【下一步】**（图3-20）。
- 在Values处点击并选择对应的值，如Data选取${Data1}和${Data2}，注意按顺序选取（如图3-21）。
- 录入样本信息，完成后点击**【下一步】**，确保参数设置无误（如图3-22）。
3.3.5 步骤五：启动分析
点击**【运行】**启动分析（图3-23）。
3.4 报告查看及结果文件下载
3.4.1 报告查看
点击导航栏**【任务管理】，当任务状态显示为completed时，代表任务已完成，点击【报告】**即可查看报告部分（如图3-24）。
3.4.2 报告下载
- 点击导航栏**【数据管理】，进入数据管理页面，根据任务的Task ID进行搜索，点击进入Task ID**文件夹（如图3-25）。
- 点击进入 report 文件夹（如图3-26）。
- 选中 report.html 文件，点击**【下载】-【镭速工具下载】**（如图3-27）。
- 点击**【传输】-【下载】-【确定】**，选择目标目录并下载报告（如图3-28）。
4. 第四章 FAQ
- 官方的单细胞流程有哪些，分别对应试剂盒的版本是什么？
scATAC-seq官方维护流程为scATAC-seq_v3，对应试剂盒DNBelab C系列高通量单细胞ATAC文库制备试剂盒套装。
- 构建Reference后gtf文件格式要求是什么？
gtf文件中染色体名称与基因组文件中的染色体名称要一致。