StereoMiner

时空组学高级分析在DCS智能云平台完成SAW标准分析后，可进行0代码高级分析，多种参数灵活配置，分析结果直观呈现，可一键投递全流程任务。主要流程包括数据预处理、聚类/注释、拟时序分析、互作分析、功能富集分析，并最终形成高级分析报告，完成时空分析交付。

单细胞组学高级分析的主要流程同时空组学类似，包括数据预处理、聚类/注释、拟时序分析、互作分析、功能富集分析，最终形成单细胞高级分析报告。

分析入口

1）交互分析入口

在交互分析页面，可根据需求选择“时空组学高级分析”或“单细胞组学高级分析”的入口进入。

2）任务入口（仅支持时空组学）

在DCS Cloud任务列表页，为每个完成时空SAW标准分析的T任务，提供高级分析入口。可点击“更多”中的“交互式工具”按钮，进入分析。

选择文件

1. 时空组学高级分析

1） 点击“选择“按钮，进入数据管理窗口选择表达矩阵gef文件。可选择项目中已存在的gef文件，或自行上传gef文件至数据管理后再进行选择。

2）支持添加多个文件，选择binsize，同时投递任务。

提示

对于cellbin.gef，无需选择binsize，均只会投递cellbin的任务。

2. 单细胞组学高级分析

1） 请选择上游单细胞流程输出结果所在的文件夹，该文件夹中需直接包含以下三个文件：“features.tsv.gz”、“barcodes.tsv.gz”、“matrix.mtx.gz”。

2） 注意：若使用云平台单细胞工作流“scRNA-seq-analysis-pipeline”输出的结果，请选择该任务结果路径下的“/.../04.Matrix/FilterMatrix/”文件夹（该矩阵为过滤后的有效数据），若选择其他文件夹可能导致结果错误。

3） 单细胞支持单个样本具有单文库或多文库运行分析，若一个样本中有多个文库，可点击矩阵文件夹后的“+”选取不同文库的数据。

提示

运行单细胞高级分析前，需手动填写每个样本的样本名称，用于区分后续单个样本的结果和任务信息。

4. 若需同时运行多个样本的流程，可点击样本名称后“+”号添加多个样本的信息。

任务投递

可选择进行全流程投递或单步投递，每个投递方式均提供操作指引。

• 全流程投递：选择文件后，点击“全流程投递”，可进行流程选择、参数设置，提交后即可一次性跑完所选的全部流程（预处理和聚类或注释流程为必选）。

• 单步投递：选择文件后，点击“单步投递”，则只进行单步流程的投递，跑完质控任务后即停止，用户可查看结果并进行下一步投递。

任务结果查看

• 可对单细胞和时空高级分析完成后的某个任务进行查看，并在任务列表中切换流程结果。

• 任务列表呈树形结构，可体现流程之间的前后依赖关系。用户可由此判断该任务结果是基于哪个前置任务进行的，任务名可支持用户在任务管理中自定义区分。

• 若需查看其他芯片的分析结果，也可在load data界面更换文件，右侧任务列表将会同步该文件的历史任务，若无历史任务则列表为空。

质控流程

对gef文件的MID Count，Gene Type，线粒体gene比例等数据进行统计，该步骤预计30min（1*1cm芯片，1G reads）。分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（QC开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。也可下载分析结果数据。

预处理流程

根据初步的统计结果，对gef文件进行细胞过滤，基因过滤，归一化，高可变基因等预处理分析。该步骤预计15min（1*1cm芯片，1G reads）。分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（PR开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。也可下载分析结果数据。

注意

预处理分析算法调用的是stereopy工具算法。当同时使用Min MID Count 和 Top N Genes过滤时，容易把有效数据全部过滤，此时，系统会将两个参数定义为None。

注释方法选择

高级分析细胞注释支持分步注释和端到端注释。默认情况下，会为您选择分步注释。单细胞组学高级分析推荐使用分布注释，端到端注释无法生成UMAP图像。

• 分步注释：首先，使用聚类算法（目前支持使用Stereopy或Spateo软件的Leiden/Louvain）进行聚类，然后基于Marker基因或数据集自动或手动进行聚类标注。
• 端到端注释：直接使用软件注释（目前支持SingleR）。

分群

预处理完成后，进行分群（cluster）和找marker基因分析。该步骤预计35min（1*1cm芯片，1G reads）。分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（CL开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。也可下载分析结果数据。

请注意：预处理完成之后，才可进行cluster和find marker分析

注：cluster和find marker分析算法调用的stereopy工具算法。

1）设置好cluster分析参数后，点击提交按钮进行分析。

2）任务提交之后，页面显示任务分析等待中。

3）分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（CL开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。可查看空间和UMAP可视化结果，单细胞高级分析只有UMAP可视化结果。

cluster分析结果空间可视化页面

cluster分析结果UMAP可视化页面

4）切换cluster，可查看不同cluster的全部marker gene。表格支持搜索、排序和下载。

marker基因页面

5. 通过数据集连接器，可查看在数据集中，marker gene对应的细胞类型，供手动注释进行参考。

注：Stereominer搜集了人和小鼠物种不同组织的200+数据集，并人工审核和处理，详细可访问:

https://www.stomics.tech/sap/stereominer/database/#/study/。

数据集页面

6. 通过知识库映射器，可查看在知识库中，marker gene对应的细胞类型，供手动注释进行参考。

注：知识库是Stereominer数据库人工搜集的如panglaodb，cellmarker，Cell Taxonomy等数据库的内容，手动注释可参考。

7）查看marker基因表达热图。

marker基因表达热图

自动注释

• 通过聚类分析得到不同细胞类群后，除了使用每个cluster的Marker基因信息对细胞类群进行初步的注释和分析之外，还可通过其他软件将细胞类群与参考数据库进行比较，以得到分群后不同细胞的细胞类群注释信息。

• SingleR 可以将细胞聚类结果中的每个cluster与参考数据库进行比较，根据该cluster与参考数据库中已知细胞类群基因表达谱的相似性对cluster进行打分，最终得到一个打分矩阵。通过打分矩阵结果即可将细胞聚类结果注释为不同的细胞类群。 该步骤预计60min（1*1cm芯片，1G reads）。分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（AA开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。也可下载分析结果数据。

• 参考数据集有三种途径可供选择：

  • SingleR自带数据集：选择“Default”，下拉选择人/鼠对应的参考数据。

  

  • 知识库数据集：选择“Stereo Database”，可根据所提供的信息选择知识库内包含的数据。

  

  • 数据管理：选择“Data Management”，可进入数据管理页面选择自定义参考数据。（注：请先下载模板文件，自行构建参考数据后上传至数据管理。）

  

• 也可跳过自动注释，分群完后直接进行手动注释的步骤。

手动注释

手动注释可在分群注释或自动注释后。若自动注释后进行手动注释，系统会将自动注释的结果展示在手动注释的第一列，可通过点击编辑按钮，进行细胞类型的修改，完成注释。手动注释完，也可重新进行分群或自动注释。请注意，若重新进行自动注释，手动注释的结果会被重置。手动注释步骤预计20min（1*1cm芯片，1G reads）。

分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（MA开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。也可下载分析结果数据。

1）根据markergene和知识库dataset参考，手动对分群（cluster）进行细胞类型注释（支持编辑/删除操作，删除后将显示为“nan”）。编辑好不同cluster细胞类型后，点击提交按钮进行分析。

2）分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（MA开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。可查看空间和UMAP可视化结果。

3)查看不同分群的表达情况

拟时序分析

拟时序分析（pseudotime analysis）也称为细胞轨迹分析（trajectory inference），是指根据不同细胞类群之间其基因差异表达的情况，获得细胞谱系的发育结果，构建细胞随着一个虚拟时间顺序的变化轨迹，以此重现细胞随时间变化而变化的过程。

基于细胞注释的结果，使用Monocle3 软件进行拟时序分析，根据软件推测的发育轨迹进行细胞类群的可视化。支持用户选择部分分群进行任务投递。

该步骤预计1h（1*1cm芯片，1G reads）。分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（PT开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。也可下载分析结果数据。

细胞发育轨迹图

根据细胞发育轨迹结果中的节点信息，结合不同细胞类群中基因表达量的变化，Monocle3可以通过机器学习算法计算处于最早发育阶段的细胞，实现拟时序分析。

在不同的细胞类群聚类结果中，选取Monocle3计算得到的Top5/Top10/Top15的Marker基因，按照已获得的拟时序结果进行基因表达量的拟时序作图。

细胞互作分析

细胞注释完成后，可居于注释的数据进行细胞互作分析，支持CellChat和Cellphonedb分析。

CellChat 是一个能够从单细胞数据中定量推断和分析细胞间通信网络的工具，利用网络分析和模式识别方法预测细胞的主要信号输入和输出，以及这些细胞和信号如何协调功能。CellChatDB数据库整合了来自KEGG和最近研究中的信号分析信息，该数据库囊括了已知的配体-受体复合物组成，包括配体-受体多聚体复合物以及几类辅酶因子。可使用CellChat工具来鉴定时空数据中的配体/受体关系和细胞间的通讯分子，研究不同细胞类型之间的相互交流及通讯网络。

CellPhoneDB是一个受配体及其相互作用的数据库，有别于其他数据库的是CellPhoneDB考虑了受配体的亚单位结构，准确的表达了异聚体复合物。

该步骤预计3h（1*1cm芯片，1G reads）。分析完成后，可在任务结果页面查看该任务（IN开头的任务号），通过查看报告按钮，进入结果查看。也可下载分析结果数据。

功能富集

细胞注释完成后，可基于注释的数据进行功能富集分析，使用clusterProfiler 软件分别对每一个细胞类群的差异基因进行GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）功能富集分析。该步骤预计0.5h（1*1cm芯片，1G reads）

GO富集分析结果图

横轴为富集基因占比，纵轴为富集到的GOterm，颜色对应P-value的值，越红表示富集效果越显著。

KEGG富集分析结果图

横轴为富集基因占比，纵轴为富集到的KEGGPathway，颜色对应P-value的值，越红表示富集效果越显著。

GO富集分析网络连接图

圆点为富集到的GOterm，圆点大小表示基因数，圆点颜色表示P-value的值，越红表示富集效果越显著；连接线的粗细表示两个GOterms之间共有的基 因数。

KEGG富集分析网络连接图

圆点为富集到的KEGGPathway，圆点大小表示基因数，圆点颜色表示P-value的值，越红表示富集效果越显著；连接线的粗细表示两个GOterms之间共有的基因数

分析参数说明

	调参模块	参数名称	中文说明	Description in English	参数默认值	参数范围
preprocessing	细胞(Bin)过滤 Cell (Bin) Filter	Min MID Count	单个细胞（或bin）中所含的最小MID数。	Minimum value of MID count expressed in a single cell (or bin).	20	[0，gef中的max值]
Min Gene Type	单个细胞（或bin）中所含的基因种类最小值。	Minimum value of gene type expressed in single cell (or bin).	1	[0，gef中的max值]
Max Gene Type	单个细胞（或bin）中所含的基因种类最大值。	Maximum value of gene type expressed in a single cell (or bin).	None	[用户设置的Min Gene Type，gef中的max值]
Max Mito Percentage	单个细胞（或bin）中线粒体基因所占比例的最大值。	Maximum percentage of mitochondrial genes in a single cell (or bin).	None	[1,100]
基因过滤/Gene Filter	Min Cell (Bin) Count	单种基因至少在该数量的细胞（或bin）中有表达。	Minimum number of cells (or bins) in which a type of gene expresses.	3	[1,100]
Max Cell (Bin) Count	单种基因至多在该数量的细胞（或bin）中有表达。	Maximum number of cells (or bins) in which a type of gene expresses.	None	[用户设置的Min Bin Count，None]
归一化/ Normalization	Method	1. log+scale：在对数尺度上进行归一化。 2. SCTransform：利用正则化负二项分布进行归一化。	1. log+scale: First perform logarithmic transformation on the original matrix, and then use scale to normalize the matrix. 2. SCTransform: Use regularized negative binomial regression to normalize the matrix.	SCTransform	[log + scale, SCTransform]
高可变基因/Highly Variable Genes	Top N Genes	保留的高变基因数量。样本所含基因数须不小于此值，否则会报错。	The number of highly variable genes retained. The number of gene type contained in the sample must be no less than this value, otherwise it will report errors.	3000	[1000, 20000]
Clustering	Clustering Method	Tool	-	-	Stereopy	[Stereopy, Spateo(SCC)]
Algorithm	-	-	leiden	[leiden, louvain]
Resolution	控制聚类数量及精细程度的参数。值越大，聚类数量越多。	The parameter that controls the number and specificity of clusters. A higher value will lead to more clusters.	0.5	[0.1,2]
Feature	选择用于后续分析的基因子集。	Choose a subset of genes used for the following analysis.	High variable genes	[All genes, High variable genes]
PCA	PCs Number	使用PCA将数据降至较低维度后主成分的数量。	The number of principal components to compute after using PCA to reduce the data to a lower dimensionality .	50	[2, 100]
Dimensional Reduction	Method	-	-	UMAP	[UMAP, tSNE]
PCs To Be Used	从PCA中生成的用于降维的主成分数量。	The number of principal components from PCA to be used for dimensional reduction.	30	[2, PCs Number]
Neighborhood Size	构建每个数据点周围局部邻域的数据点数量。小的邻域尺寸可以创建更多局部特征和精细的数据表现，而较大的邻域尺寸可以创建更多全局特征和粗略的数据表现。	The number of data points that are considered in the construction of the local neighborhood around each data point. A smaller value can create more local features and fine-grained details, while a larger value can create more global features and a more coarse-grained view.	20	[2, 100]
Auto annotation		Method	-	-	SingleR	[SingleR]
	Reference	请先选择来源，再选择文件。 1.Default：包含算法中自带的reference。 2.StereoMiner Database：可选择知识库中的reference。 3.Data Management：可选择已自行上传至数据管理中的reference。支持h5ad和rds格式，可在下方下载模板。	Please select the source first, then select a reference. 1. Default: Includes the references from SingleR's built-in database. 2. StereoMiner Database: Select references from StereoMiner Database. 3. Data Management: Select references already uploaded to data management. H5AD and RDS formats are supported, and templates can be downloaded below.	Source: Default Reference: HumanPrimaryCellAtlasData	[Default, Stereo Database, Data Management]
	Feature	选择一类基因进行注释。 de: 使用聚类间的差异表达基因。 sd: 使用聚类间的高可变基因。 all: 使用所有基因。	Choose a type of gene to perform annotation. 1. de: Genes that are differentially expressed between labels 2. sd: Genes that are highly variable across labels 3. all: Not perform any feature selection.	de	[de,sd,all]
	De.Method	若选择“de”参数，计算差异表达基因的方法。 1. classic: 对数差异变化排序。 2. wilcox: Wilcoxon秩和检验。 3. t: Welch t检验。	Select method (if choose de) for calculating differential expression gene. 1. classic: Log-fold changes ranked. 2. wilcox: Wilcoxon rank-sum test. 3. t: Welch t-test.	classic	[classic,wilcox,t]
Pseudotime analysis		Tool	-	-	monocle3	[monocle3]
Interaction analysis		Tool	-	-	CellChat	[CellChat,Cellphonedb]
	Reference	-	-	Human	[Human,Mouse]
Functional Enrichment		Tool	-	-	clusterProfiler	[clusterProfiler]
	Reference	-	-	Human	[Human,Mouse]
	P-value	用于选择显著差异表达的基因，并调整富集分析的p值截止值。	The P-value is used to select significantly differentially expressed genes and adjust the P-value cutoff on enrichment analysis.	0.05	[0.001,0.01,0.05]
	P AdjustMethod	-	-	BH	[holm", "hochberg", "hommel", "bonferroni", "BH", "BY", "fdr", "none" ]

时空组学交付报告生成

• 仅时空组学高级分析支持生成报告，单细胞组学暂不支持。
• 语言可选中/英文。
• 支持自定义Logo。
• 可自选报告模块，对应报告目录下“分析结果” -> “4 数据分析”的各个子模块。默认全选。

注意

若gef文件非平台标准流程所产出，则无“质控数据结果统计”部分的数据。

• 支持选择生成报告所需的任务数据，系统会根据跳转时的当前任务，自动填充相关联的任务数据。若切换上级任务，下级任务的下拉列表也会自动过滤。

• 支持选择多张芯片同时生成报告。操作步骤如下：

  • 1.从当前任务中进入报告模块，则当前芯片文件会被自动选中，并进行任务号填充。
  • 2.点击+号选择新增文件。

  

  • 3.支持通过文件类型、任务号、SN号、样本号、创建者筛选文件。任务号可在该芯片对应的高级分析任务列表中进行查看。（注意：仅运行过历史任务的文件才可被选择。）

  

任务号

• 4.注意：请确保多张芯片所包含的任务模块一致，否则将无法生成报告。
• 报告支持下载（.html文件）和打印（.pdf文件）。

注意

仅在打印为pdf时可生成页码及目录。

• 支持“文件整合”功能：所选的报告模块所生成的结果（除h5ad文件外），将全部整合到数据管理模块的下述路径中，方便用户快速整理与交付。